KARAKTERISASI ENZIM ORGANOFOSFAT HIDROLASE DARI Pseudomonas putida PADA SUBSTRAT DIAZINON DAN MALATHION
Abstrak
Organofosfat
hidolase (OPH) merupakan enzim intraseluler yang diisolasi dari bakteri Pseudomonas
putida. Enzim ini mampu mendegradasi pestisida golongan organofosfat.
Enzim OPH yang telah diisolasi dari Pseudomonas putida, dimurnikan
dengan metode fraksinasi bertingkat menggunakan amonium sulfat dengan tingkat
kejenuhan 0-45% dan 45-65%. Uji aktivitas enzim dilakukan dengan mereaksikan
OPH dengan substrat diazinon maupun malathion pada berbagai konsentrasi dan pH,
pada temperatur ruang selama 30 menit. Penentuan pH optimum OPH dilakukan
dengan mengukur aktivitas enzim pada variasi pH (7,5; 8; 8,5; 9; 9,5). Penentuan
parameter kinetika reaksi enzimatis (Vmaks dan KM) dilakukan dengan mereaksikan
enzim OPH pada variasi konsentrasi
diazinon (6; 8; 10; 15; 20) ppm dan malathion (10; 15; 20; 25; 30) ppm. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa fraksi pengendapan 0-45% mempunyai aktivitas
optimum 0,035 unit untuk diazinon dan 0,067 unit untuk malathion. pH optimum
yang dicapai berdasarkan aktivitas tertinggi untuk diazinon pH 9 dan malathion
pH 7,5. Hasil penentuan kinetika reaksi enzimatis OPH didapatkan Vmaks = 3,5
x10-3µmol/menit dan KM = 7,4 mg/L untuk diazinon, sedangkan untuk malathion Vmaks
= 16,8 x 10-3 µmol/menit dan KM = 19,24 mg/L.
Pendahulan
Organofosfat
hidrolase (OPH) mampu mengkatalisis reaksi hidrolisis pestisida organofosfat.
Pada reaksi hidrolisis ini, enzim akan menghidrolisis ikatan fosfoester dari organofosfat
serta mengurangi toksisitas organofosfat. [1]. Pada penelitian biologi
molekuler, OPH telah dikembangkan terus-menerus. Beberapa OPH telah diisolasi
dan dimurnikan dari berbagai mikroorganisme [2]. Berbagai bakteri organofosfat
yang dapat menurunkan toksisitas organofosfat, termasuk Pseudomonas diminuta
MG, Flavobacteriumsp, Arthrobacter sp, Penicilliumlilacinum BP303, telah
diisolasi dari lingkungan yang terdapat senyawa organofosfat [3]. Organofosfat
merupakan jenis pestisida yang direkomendasikan oleh Departemen pertanian
Republik Indonesia [4]. Aktivitas spesifik enzim yang dimurnikan mempunyai
aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan ekstrak kasarnya sehingga menghasilkan
suatu analisis yang lebih selektif dan sensitif. Enzim murni dapat diperoleh
dengan mengisolasi enzim dari jaringan sehingga komponen sel dapat terpisahkan
dengan enzim [5]. Pada penelitian ini dipelajari lebih lanjut mengenai
Aktivitas spesifik, uji kadar protein dan karakterisasi enzim OPH dengan
menggunakan substrat diazinon dan malathion. Sehingga dapat mengetahui
kemampuan enzim OPH dalam mendegradasi pestisida organofosfat diazinon dan
malathion yang meliputi pengaruh variasi konsentrasi dan pH untuk menentukan
hasil optimumnya dari bakteri Pseudomonas putida.
METODA
PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat
yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik (Bosch PE 620),
inkubator (Heraeus Type B 5042), sentrifuge dingin Jouan (tipe MR 18-22),
autoklaf (Model LS-C35L Electric Heater Vertical Sterilizer), shaker (merek
Edmund tipe 25), pH meter (merek schoot-sgerate tipe CG.820), sentrifuse ( Refrigerated
sentrifuse (bio fuge primo) Thermoscintific 10000/putaran), spektrofotometer
UV-Vis dan peralatan gelas laboraturium. Bahan yang digunakan pada penelitian
ini dengan kualitas for microbiology seperti yeast extract,
nutrient agar, dan larutan BSA 22% (b/v), sedangkan kualitas pro analisis,
antara lain organofosfat diazinon, organofosfat malathion, NaOH, HCl 0,1M , H2SO4
96%, CuSO4.5H2O, asam asetat glacial 99,7%, (NH4)2SO4, K2HPO4, KH2PO4, sukrosa,
akuades, Na-K-Tartrat, FeSO4.7H2O, MgSO4.4H2O, Na2MOO4.2H2O, ZnSO4.7H2O,tris
amino metan.
Prosedur
Uji kadar protein
Penentuan
kadar protein dilakukan menggunakan reagen Biuret. Sebanyak 2 mL larutan enzim
dengan tingkat kejenuhan ammonium sulfat 0-45% dan 45-65% ditambah 8 mL reagen
Biuret dan 2 mL larutan BSA 5000 ppm, kemudian dikocok dan didiamkan selama 30
373 menit pada temperatur 50oC. Selanjutnya diukur absorbansinya pada
panjang gelombang maksimum BSA yaitu 540 nm sehingga kadar protein diketahui
dengan memplotkan nilai absorbansi pada persamaan regresi kurva standar BSA.
Sebagai blanko dipipet 2 mL akuades, 8 mL reagen Biuret dan 2 mL buffer tris
asetat pH 7,5 selanjutnya diperlakukan sama seperti perlakuan sebelumnya.
Penentuan aktivitas spesifik OPH
Penentuan
aktivitas spesifik enzim dilakukan setelah pemurnian dan dialisis pada enzim
OPH. Aktivitas spesifik dapat diperoleh setelah menghitung aktivitas enzim dan
kadar proteinnya, dinyatakan dalam satuan U/ mg. Penentuan dilakukan dengan
cara mengukur jumlah senyawa pereduksi yang dihasilkan dari reaksi hidrolisis
substrat organofosfat. Enzim yang telah dimurnikan ditentukan aktivitas
spesfifiknya dengan cara, diambil 2 mL masingmasing substrat diazinon dan
malathion yang telah dilarutkan dengan buffer tris asetat pH (7,5; 8; 8,5; 9;
9,5). Ditambahkan 0,1 mL enzim hasil pemurniaan dengan tingkat kejenuhan 0-45%
serta 45-65%. Diinkubasi selama 30 menit, kemudian diukur absorbansi pada
panjang gelombang maksimum substrat diazinon 247 nm dan malathion 221 nm.
Karakterisasi
enzim OPH
Karakterisasi
Organofosfat hidrolase ditentukan dengan menguji aktivitas spesifiknya pada
variasi pH (7,5; 8; 8,5; 9; 9,5), temperatur ruang, waktu inkubasi 30 menit,
dan variasi konsentrasi substrat diazinon (0; 6; 8; 10; 15; 20) ppm dan
substrat malathion (0; 10; 15; 20; 25; 30) ppm serta dihitung nilai Vmaks dan KM.
Tahapan karakterisasi variasi konsentrasi enzim dilakukan untuk menentukan pH
optimum dan parameter kinetik Vmaks dan KM, dengan cara sebagai berikut,
dilakukan penambahan 2 mL substrat dengan masing - masing konsentrasi yang
berbeda untuk diazinon dan malathion yang telah larut dengan buffer tris asetat
dengan variasi pH (7,5; 8; 8,5; 9; 9,5). Substrat dengan variasi pH dan
konsentrasi dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan enzim kasar
OPH hasil fraksinasi masing – masing 0,1 mL. Selanjutnya diukur absorbansinya
dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang masing – masing subtrat
diazinon 247 nm dan malathion 221 nm. Penentuan nilai Vmaks dan KM dapat
dihitung melalui persamaan y = ax + b pada kurva hubungan antara konsentrasi
substrat [S] terhadap kecepatan enzim (V). Dengan demikian harga 1 / Vmaks dan
nilai Vmaks didapat, demikian juga nilai 1 / KM dan KM.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Penentuan Kadar Protein dan Aktivitas Spesifik Enzim OPH
Kadar
protein ditentukan dengan menginterpolasikan serapan sampel pada kurva baku BSA
Y= 3.10-5 X + 0,023. Kadar protein yang diperoleh untuk tingkat kejenuhan 0-45%
adalah 1,355 mg dan 45-65% adalah 4,177 mg. Apabila kadar protein larutan enzim
sudah diketahui maka dapat ditentukan aktivitas spesifiknya. Aktivitas spesifik
OPH dengan substrat diazinon dan malathion pada tiap tingkat kejenuhan amonium
sulfat dapat dilihat pada Tabel 1.
Penentuan pH optimum dengan variasi konsentrasi substrat
pH
optimum merupakan pH dimana enzim memiliki aktivitas paling tinggi. Pada pH
optimum muatan sisi aktif enzim sesuai dengan substrat sehingga interaksi yang
terjadi optimal. Konsentrasi substrat dibuat dengan variasi (6; 8; 10; 15; 20)
ppm untuk diazinon dan malathion (10; 15; 2; 25; 30) ppm pada pH (7,5; 8; 8,5;
9; 9,5). Aktivitas spesifik terbesar enzim OPH, terdapat pada tingkat kejenuhan
0-45%. Oleh karena itu untuk menentukan pH optimumnya maka dilakukan pada
0-45%. Pengaruh pH terhadap aktivitas spesifik enzim OPH dapat dilihat pada
Gambar 1 dan Gambar 2:
Berdasarkan
Gambar 1 dan Gambar 2 menunjukkan bahwa aktivitas spesifik tertinggi diazinon
sebesar 0,035 unit/mg pada pH 9 dan malathion sebesar 0,067 unit/mg pada pH 7,5.
Penentuan Kinetika Kimia (Vmaks dan KM)
Penentuan
Vmaks dan KM diperlukan untuk mengetahui karakteristik suatu enzim. Nilai Vmaks
dan KM menggambarkan kemampuan dan kecepatan enzim terhadap substrat. Vmaks
merupakan kecepatan reaksi pada saat enzim telah jenuh dengan substrat. KM menunjukkan
konsentrasi substrat yang menyebabkan kecepatan reaksi enzimatis mencapai
setengah maksimum. Penentuan Vmaks dan KM OPH dilakukan dengan dengan variasi
konsentrasi substrat diazinon (6; 8;15; 20) ppm dan malathion (10; 15; 25; 30)
ppm, pada pH optimumnya masing – masing dengan temperatur ruang dan waktu
inkubasi 30 menit. Nilai Vmaks dan KM dapat dipermudah dengan menggunakan
penyederhanaan Lineweaver dan Burk, dimana Vmaks dan KM ditentukan dengan
membuat persamaan garis lurus hubungan antara 1/[S] dan 1/ V dapat dilihat pada
Gambar 3 dan Gambar 4.
Berdasarkan
hasil perhitungan dari grafik hubungan antara 1/[S] dengan 1/[V] menunjukkan
nilai Vmaks dan KM untuk substrat diazinon adalah sebesar 0,0035µmol/menit dan
7,8 mg/L, sedangkan untuk substrat malathion diperoleh nilai Vmaks dan KM sebesar
0,0168 µmol/menit dan 19,24 mg/L.
KESIMPULAN
1.
Enzim organofosfat hidrolase dapat mendegradasi organofosfat diazinon menjadi
2- isopropil-6-pirimidin-4-il dan O,O-dietil fosforoditioat, aktivitas spesifiknya
pada tingkat kejenuhan amonium sulfat 0-45% sebesar 0,035 unit, sedangkan
organofosfat malathion menjadi O,O-dimetilfosforoditioat dan dietil maleat
dengan aktivitas spesifik 0,067 unit.
2.
Pengukuran Aktivitas spesifik tertinggi enzim organofosfat hidrolase dengan
substrat diazinon, terdapat pada pH 9 dengan nilai Vmaks dan KM adalah 0,0035
µmol/menit dan 7,8 mg/L, dan substrat malathion pada pH 7,5 dengan nilai Vmaks dan
KM adalah 0,0168 µmol/menit dan 19,24 mg/L.
Penulis : Anik Sri Wijaya, Sasangka Prasetyawan, Anna Roosdiana
Nama Jurnal :
KARAKTERISASI ENZIM ORGANOFOSFAT HIDROLASE DARI Pseudomonas putida PADA SUBSTRAT DIAZINON DAN MALATHION
Volume :
Vol 2, No 1 (2014)
